Гетерологичная продукция D

Jan 12, 2024

Том 13 научных докладов, номер статьи: 8551 (2023) Цитировать эту статью

469 доступов

Подробности о метриках

Туберкулез (ТБ) является второй по значимости причиной смертности от одного инфекционного заболевания после COVID-19. Несмотря на столетия усилий, нынешняя противотуберкулезная вакцина не обеспечивает эффективной профилактики легочного туберкулеза, не способствует укреплению коллективного иммунитета и не предотвращает передачу заболевания. Поэтому необходимы альтернативные подходы. Мы стремимся разработать клеточную терапию, которая позволит получить эффективный антибиотик в ответ на туберкулезную инфекцию. D-циклосерин (D-CS) — антибиотик второй линии при лечении туберкулеза, который ингибирует синтез клеточной стенки бактерий. Мы определили, что D-CS является оптимальным кандидатом для противотуберкулезной клеточной терапии из-за его эффективности против туберкулеза, относительно короткого пути биосинтеза и низкой частоты возникновения резистентности. Первый решительный шаг на пути к синтезу D-CS катализируется L-серин-O-ацетилтрансферазой (DcsE), которая превращает L-серин и ацетил-КоА в O-ацетил-L-серин (L-OAS). Чтобы проверить, может ли путь D-CS быть эффективной профилактикой туберкулеза, мы попытались экспрессировать функциональный DcsE в клетках A549 в качестве модели легких человека. Мы наблюдали экспрессию DcsE-FLAG-GFP с помощью флуоресцентной микроскопии. DcsE, очищенный из клеток A549, катализирует синтез L-OAS, что наблюдалось методом ВЭЖХ-МС. Таким образом, клетки человека синтезируют функциональный DcsE, способный превращать L-серин и ацетил-КоА в L-OAS, что демонстрирует первый шаг на пути к производству D-CS в клетках человека.

Туберкулез (ТБ) – это преимущественно респираторное инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Mycobacterium Tuberculosis (Mtb)1. Вакцина Bacillus Calmette-Guéren (BCG) против туберкулеза имеет различную степень защиты от туберкулеза легких, которая не сохраняется во взрослом возрасте и может привести к побочным эффектам (обзор см. в ссылке 3). Другие попытки вакцинации, такие как вакцина MVA85A, были разработаны в качестве дополнения к БЦЖ, но потерпели неудачу в испытаниях фазы IIIb, поэтому профилактика туберкулеза остается труднодостижимой4.

Разработка эффективной профилактики туберкулеза открывает важную возможность для альтернативных подходов. Успешная история химиопрофилактики и новые методы генной терапии заложили основу для возможности разработки генетической профилактики, вырабатывающей антибиотик в клетках человека (генетическая химиопрофилактика). Изониазид использовался в качестве химиопрофилактики, которая снижает вероятность развития туберкулеза на 40% в течение 2 и более лет5. Недавно была обнаружена эффективность генной терапии против рака. Терапия Т-клетками химерного антигенного рецептора (CAR-T) генетически модифицирует Т-клетки, включив в них химерный антигенный рецептор. Это помогает Т-клеткам воздействовать на раковые клетки, особенно на острый лимфобластный лейкоз и крупные В-клеточные лимфомы6. В клиническом исследовании, включавшем детей с острым лимфобластным лейкозом типа B для лечения CAR T-22, 17 из 20 участников достигли как минимум годовой ремиссии7. После того, как терапия CAR-T продемонстрировала возможность генетической модификации клеток для нацеливания на раковые клетки, были разработаны многочисленные альтернативные методы доставки и клеточная терапия8. Учитывая эффективность химиопрофилактики и появление генной терапии, мы стремимся изучить возможность генетической химиопрофилактики, которая производит антибиотик для предотвращения туберкулеза.

После оценки всех противотуберкулезных антибиотиков первой и второй линии мы выбрали путь биосинтеза D-циклосерина (D-CS) в качестве оптимального кандидата для генетической химиопрофилактики. В этом исследовании мы сосредоточились на первом ферменте биосинтетического пути, L-серин-O-ацетилтрансферазе (DcsE), который производит O-ацетил-L-серин (L-OAS) из L-серина и ацетил-КоА9 (рис. 1). Мы стремились проверить, может ли функциональный DcsE экспрессироваться в клетках A549, модели легочных клеток человека типа II10. Мы трансфицировали DcsE, меченный FLAG и зеленым флуоресцентным белком (GFP), в клетки A549 и наблюдали высокий уровень продукции DcsE-FLAG-GFP с помощью флуоресцентной микроскопии. Мы наблюдали in vitro синтез L-OAS, в частности, с помощью очищенного DcsE с использованием ВЭЖХ-МС. Мы предоставляем доказательства того, что функциональный DcsE может быть синтезирован в клетках человека в качестве первого шага профилактического синтеза D-CS.