Использование Монолита

Jun 14, 2023

Рисунок 1:Хроматограмма анализа реакции IVT с использованием монолитной хроматографической колонки CIMac PrimaS.

Транскрипция in vitro (IVT) является важнейшим этапом производства информационной РНК (мРНК). На вебинаре в марте 2022 года Рок Секирник (руководитель отдела разработки процессов применения мРНК и плазмидной ДНК (пДНК) в BIA Separations, входящей в состав Sartorius) объяснил, что оптимизация концентраций реагентов, используемых во время IVT, помогает максимизировать количество вырабатываемой мРНК. Разработчики лекарств испытывают острую потребность в аналитических методах, позволяющих измерять IVT в режиме реального времени. Секирник продемонстрировал, как монолитные хроматографические колонки CIMac PrimaS позволяют проводить оперативный анализ IVT, включая мониторинг концентрации нуклеозидтрифосфатов (НТФ), блокирующих реагентов и плазмид.

Презентация Секирник отметил, что молекула мРНК из 4000 нуклеотидов, подобная той, которая присутствует в мРНК-вакцинах против SARS-CoV-2, имеет вес ~ 1,3 МДа — примерно в 10 раз больше, чем стандартное антитело IgG. Информационная РНК также несет отрицательный заряд и становится гидрофобной при воздействии высоких концентраций соли. Чтобы обеспечить трансляцию белка, он должен иметь 5'-кэп и полиаденилированный (поли-А) хвост. Хвосты поли-А могут быть закодированы в матрице ДНК, используемой для транскрипции, или добавлены ферментативно после IVT. Аналогично, 5'-капсулы могут быть добавлены во время или после IVT.

Учитывая такие свойства, разработчикам лекарств необходимы аналитические методы, которые могут измерять выход мРНК и эффективность связывания в режиме реального времени. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) полезна для таких оценок, но аналитики должны выбрать среду для разделения, которая обеспечивает подходящую химию связывания, достаточно большую площадь поверхности для мРНК и возможность быстрого анализа. В средах на основе шариков, содержащих пористые частицы, диффузия ограничивает массоперенос, что требует длительного времени анализа и ограничивает возможности оперативной оценки. Шарики также создают противоток, создавая напряжение сдвига, которое снижает восстановление.

Монолитные колонны CIMac PrimaS основаны на конвективном массопереносе через неподвижную фазу полиметакрилата. Разделение основано на анионообменных и мультимодальных взаимодействиях с водородными связями. Ламинарный поток через колонку минимизирует напряжение сдвига. По сравнению с пористыми частицами микроканалы обеспечивают гораздо большую площадь поверхности для связывания мРНК. Поскольку в каналах отсутствуют тупиковые поры, их связывающая способность и разрешение остаются одинаковыми при любой скорости потока.

Эта функция позволяет аналитикам обрабатывать образцы достаточно быстро, чтобы оценить IVT в реальном времени без снижения разрешения. Секирник отметил, что один анализ позволяет разделить и количественно оценить мРНК, пДНК, кэпирующие реагенты и отдельные NTP (рис. 1). Результаты генерируются менее чем за три минуты.

Такие возможности позволяют отслеживать и контролировать кинетику продукции мРНК, включая эффективность 5'-кэпирования. Секирник объяснил, что если используется экзонуклеаза, которая избирательно разрушает некепированную мРНК, то образец можно проанализировать на концентрацию мРНК, обработать ферментативно и снова проанализировать для количественного определения непереваренных молекул. Сравнение значений концентрации до и после лечения позволит выявить эффективность ограничения реакции IVT. Аналитики могут соответствующим образом корректировать режимы кормления и концентрации реагентов для оптимизации кэпирования и выхода мРНК.

Секирник продемонстрировал эту возможность, используя данные периодического процесса IVT. Компания Sartorius инициировала IVT с соотношением гуанозинтрифосфата (GTP) и аналога антиреверсивного кэпа (ARCA) 1:4. Через час после начала процесса эффективность укупорки была высокой (80%), но выход был низким. Затем команда использовала стратегию кормления, чтобы регулировать уровни NTP на протяжении всей реакции, сохраняя при этом соотношение GTP:ARCA. Такие изменения увеличили выход в шесть раз (до 11,7 мг/мл) без снижения эффективности укупоривания (80%) или качества продукта.

Используя такой рабочий процесс, аналитики могут быстро получить информацию как об эффективности ограничения, так и о доходности. Программное обеспечение Sartorius PATfix включает предварительно загруженные аналитические последовательности и инструменты для облегчения мониторинга процесса. Компания также предлагает монолитные колонки с другими химическими составами связывания, чтобы предоставить множество инструментов для производства мРНК и анализа процессов.