Метод параллельного микромасштабного мечения белков и точного контроля средней степени мечения (aDoL).

Dec 02, 2023

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 8961 (2023) Цитировать эту статью

70 доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Широко используемый подход к конъюгации белков заключается в реакции остатков лизина с NHS- или другими активными эфирами. Однако точно контролировать степень мечения (DoL) сложно из-за нестабильности активного эфира и изменчивости эффективности реакции. Здесь мы предоставляем протокол для лучшего контроля aDoL с использованием существующих реагентов Click Chemistry без меди. Это двухэтапная реакция с одной очисткой между ними. Вкратце, интересующие белки сначала активировали с помощью азида-NHS. После удаления непрореагировавшего азида-NHS белок-N3 затем подвергается реакции с ограниченным количеством комплементарного клик-тега. Наши исследования показали, что клик-тег полностью реагирует с белком N3 после 24 часов инкубации и, следовательно, не требует дополнительных этапов очистки. Таким образом, aDoL равен входному молярному соотношению клик-тега и белка. Более того, этот подход предлагает гораздо более простой и экономичный способ параллельного микромаркирования. После предварительной активации белка с помощью N3-NHS любой флуорофор или молекула с дополнительной клик-тегой может быть присоединена к белку путем смешивания двух ингредиентов. Количества белка, используемого в реакции щелчка, могут быть любыми. В одном примере мы пометили антитело параллельно с 9 различными флуорофорами, используя в общей сложности 0,5 мг антитела. В другом примере мы пометили Ab целевым значением aDoL от 2 до 8. В исследовании по сравнению стабильности мы обнаружили, что конъюгированный флуорофор с использованием предложенного протокола щелчка оставался прикрепленным к белку дольше, чем при стандартном мечении флуорофором NHS.

Белки играют центральную роль в биологии, и сделать их видимыми или обнаруживаемыми крайне важно для исследователей, изучающих их функции и взаимодействия. В 2001 году Шарплесс опубликовал знаковую статью, описывающую простую стратегию соединения двух молекул путем «щелкания»1. Позднее Мелдаль и Бертоцци развили химию дальше и сделали ее доступной для широкого применения2,3, за что 20 лет спустя их работы были признаны и удостоены Нобелевской премии по химии. Биоортогональная химия или клик-химия продемонстрировала большие преимущества для нацеливания с высокой специфичностью на модифицированные отдельные белки с помощью зондов или меток в сложных системах4,5,6,7,8,9,10. Также были достигнуты другие значительные успехи в методах химио- и региоселективного мечения для достижения единой метки, прикрепленной к нативным белкам11,12. Подробные обзоры и книги по биоконъюгации белков можно найти в 13,14,15. Стоит также отметить, что остаток цистеина является еще одной популярной мишенью для сайт-специфической конъюгации белков. Большинство белков не содержат нативных свободных тиолов, на которые можно воздействовать, а восстановление дисульфидных связей может иметь вредные последствия для структуры, поэтому введение одного остатка цистеина посредством точечной мутации является предпочтительным подходом для прикрепления одной метки к точному местоположению белка. . Независимо от вышеупомянутых подходов, классический эфир N-гидроксисукцинимида (NHS) и другие активные эфиры остаются предпочтительной функциональной группой для прикрепления флуорофора, хромофора, биотина и ДНК к белку через остаток лизина16,17. Обилие остатков лизина в большинстве белков упрощает мечение, и это одностадийная реакция плюс одностадийная очистка. Тем не менее, из-за нестабильности (гидролиза) активного эфира, непостоянства эффективности реакции и опасений, что чрезмерное количество меток повлияет на функцию белка18, эта задача остается сложной задачей.

Здесь мы описываем метод маркировки, который гарантирует целевую aDoL с использованием легкодоступных химических реагентов, не содержащих меди. Сайты прикрепления стохастически нацелены на остатки лизина на поверхности белка, а aDoL представляет собой среднее количество меток (флуорофоров), конъюгированных с каждым белком. Это двухэтапная реакция с одной промежуточной стадией очистки (показана на рис. 1). На первом этапе белок активировали N3-NHS, а избыток N3-NHS удаляли после реакции. На втором этапе белок-N3 смешивали с флуорофором-DBCO в молярном соотношении, эквивалентном желаемому aDoL. После 24-часовой инкубации меченый белок готов к использованию.