Трансформация листьев для эффективной случайной интеграции и целенаправленной модификации генома кукурузы и сорго

Nov 12, 2023

Природные растения, том 9, страницы 255–270 (2023 г.) Процитировать эту статью

18 тысяч доступов

5 цитат

32 Альтметрика

Подробности о метриках

Трансформация видов трав традиционно основывалась на незрелых зародышах и поэтому ограничивалась несколькими основными культурами Poaceae. Другие эксплантаты трансформации, включая ткань листьев, были исследованы, но с низкими показателями успеха, что является одним из основных факторов, препятствующих широкому применению редактирования генома для улучшения сельскохозяйственных культур. В последнее время трансформация листьев с использованием морфогенных генов Wuschel2 (Wus2) и Babyboom (Bbm) успешно используется для Cas9-опосредованного мутагенеза, но сложные приложения по редактированию генома, требующие скрининга большого количества регенерированных растений, остаются неуловимыми. Здесь мы демонстрируем, что усиленная экспрессия Wus2/Bbm существенно улучшает трансформацию листьев кукурузы и сорго, позволяя восстанавливать растения с Cas9-опосредованным выпадением генов и целевой вставкой генов. Более того, с использованием конструкции Wus2/Bbm, оптимизированной для кукурузы, были успешно получены эмбриогенный каллус и регенерированные проростки у восьми видов, охватывающих четыре подсемейства трав, что позволяет предположить, что это может привести к созданию универсального общесемейного метода трансформации и редактирования генома Poaceae.

Генетическая трансформация и регенерация растений с новыми фенотипами стала прорывом в ранней биотехнологии растений и породила большие надежды среди ученых-растений. Однако вскоре после первого сообщения об успешной трансформации Nicotiana tabacum с использованием инфекции Agrobacterium1 стало очевидно, что табак является исключением, и использование потенциала этой технологии для выращивания основных сельскохозяйственных культур будет невозможно из-за плохой трансформации и/или регенерации2. Поэтапное улучшение трансформации продолжалось для различных видов растений, но для многих из них этот процесс был ограничен из-за невосприимчивости к манипуляциям in vitro. Поиск наилучшего сочетания метода трансформации и системы культивирования для каждой культуры потребовал оценки различных эксплантов, начиная от отдельных клеток, таких как протопласты; к эмбриональным тканям, таким как меристема, щиток или семядоли; к тканям, полученным из проростков, таким как апикальные/подмышечные меристемы, гипокотиль или листья; и, наконец, альтернативные варианты.

Недавнее развитие технологий редактирования генома на основе CRISPR (кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами) – Cas (CRISPR-ассоциированных) нуклеаз еще больше обостряет потребность в улучшенных и эффективных процессах трансформации3. РНК-направляемые Cas-нуклеазы генерируют целевые двухцепочечные разрывы в геноме, которые восстанавливаются либо посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), либо путем гомологического восстановления (HDR). NHEJ склонен к несовершенной репарации и часто приводит к небольшим вставкам или делециям, тогда как HDR можно использовать для введения заранее определенных модификаций путем предоставления матрицы донорской ДНК с областями, гомологичными с сайтом двухцепочечного разрыва.

Со времени первых сообщений о редактировании генома табака, арабидопсиса и риса, опосредованного Cas9, список редактируемых видов растений продолжал расширяться4,5,6,7. Однако, хотя мутагенез, опосредованный NHEJ, и нокауты генов в настоящее время являются обычной практикой, другие типы редактирования генома (такие как HDR-опосредованные вставки генов, крупномасштабные делеции, инверсии и транслокации) происходят с гораздо меньшей частотой и требуют большого количества растений. быть регенерирован и проверен, чтобы найти экземпляр с желаемой модификацией. Это ограничение справедливо для большинства видов Poaceae (например, риса Индика, кукурузы, пшеницы, ячменя, сорго и просо), где методы трансформации основаны на незрелых эмбрионах и, как правило, остаются в значительной степени зависимыми от вида и/или генотипа. ограничивая их широкомасштабное развертывание. Кроме того, постоянная круглогодичная поставка незрелых эмбрионов в качестве трансформационного эксплантата требует тепличной инфраструктуры, что делает ее непомерно ресурсной и затратной для большинства академических учреждений. Следовательно, услуги по трансформации стали необходимостью8. Таким образом, улучшенные процессы трансформации с высокой частотой регенерации становятся предпосылкой для этих сложных приложений редактирования генома9.